Porém, algumas considerações devem ser feitas pois assim que a cuba é fechada os seguintes processos iniciam-se:

:: O equilíbrio entre os componentes do solvente de desenvolvimento e sua fase de vapor (1). Dependendo da pressão de vapor dos componentes individuais a composição da fase gasosa pode ser significativamente diferente da composição do solvente de desenvolvimento

:: Enquanto a fase estacionária (placa) estiver seca adsorverá moléculas da fase gasosa. Este processo é também um equilíbrio, chamado saturação. Particularmente os componentes polares serão removidos da fase gasosa e carregados para a superfície da fase estacionária (2)

:: Simultaneamente, a parte da placa que ainda está úmida com a fase móvel interage com a fase gasosa (3). Assim, especialmente o componente menos polar do líquido é liberado para a fase gasosa.

:: Durante a migração, os componentes da fase móvel podem ser separados pela fase estacionária sob certas condições, causando a formação de fronts secundários

Com a exceção de líquidos com um único componente (solventes puros), o solvente de desenvolvimento e a fase móvel, estritamente falando, não são os mesmos. Suas composições mudam com o progresso da cromatografia. Infelizmente, os termos “Solvente de Desenvolvimento” e “Fase Móvel” são freqüentemente usados como sinônimos. Na verdade, apenas o líquido na cuba pode ser chamado de Solvente de Desenvolvimento enquanto que o líquido que se move através dos constituintes da placa é a Fase Móvel. Apenas a composição do solvente de desenvolvimento no momento em que ele é colocado na cuba é realmente conhecido.

Os processos (1) e (2) podem ser experimentalmente melhorados por:

:: Revestindo a cuba internamente com papel de filtro embebido em solvente de desenvolvimento

::  Aguardando um certo tempo entre a colocação do solvente de desenvolvimento dentro da cuba e o início da cromatografia – Saturação da Cuba

::  Permitindo a interação da placa com a fase gasosa antes do desenvolvimento do cromatograma, isto é, sem contato com o solvente de desenvolvimento – Pré Condicionamento

As interações (2) e (3) podem ser afetadas pela colocação de uma placa contrária a uma distância de alguns milímetros da placa cromatográfica. Isto é chamado“Configuração Sanduíche”.

Na maioria dos casos em Cromatografia Planar não há um equilíbrio entre as fases móvel, estacionária e gasosa. Devido a isto é muito difícil descrever matematicamente corretas as condições de desenvolvimento.

Resultados cromatográficos reprodutíveis podem ser apenas esperados quando todos os parâmetros forem mantidos os mais constantes possíveis. A forma e a saturação da cuba atuam como papéis predominantes para tal.

Infelizmente isso significa que o resultado cromatográfico é diferente em cada cuba! Não existem cubas “boas” ou “ruins”, entretanto pode-se controlar melhor os parâmetros em algumas cubas do que em outras, isto é, algumas cubas são mais reprodutíveis que outras.

Além da forma “clássica” com cubas verticais ou cubas horizontais, pode-se desenvolver o cromatograma de maneira automática - ADC2 - ou por meio de gradientes de solventes.

Como?

Através do equipamento chamado AMD-2

Automated Multiple Development

O AMD-2 é o único método de sucesso que permite reprodutibilidade com o uso de sílica gel como fase estacionária em eluição por gradiente. Em cromatografia líquida o gradiente só é possível através de colunas de fase reversa. A sílica gel não pode ser usada devido à degradação irreversível em usos múltiplos. No caso da Cromatografia Planar isto não é relevante.

Princípio do AMD-2:

O cromatograma é desenvolvido repetidamente na mesma direção

A cada corrida parcial, a distância de migração do solvente é maior que a anterior

Entre as corridas parciais o solvente é completamente removido da cuba, e a placa é seca através de vácuo

Cada corrida parcial utiliza um solvente com menor força de eluição que o anterior. Com isso um gradiente de eluição passo a passo é formado

A combinação do efeito de foco e o gradiente resulta em bandas extremamente estreitas. A largura típica do pico é de aproximadamente 1mm. Isto significa que com a distância de separação de 80mm, até 40 componentes podem ser completamente resolvidos - alto poder de separação

Toda as informações sobre tipos e volume de solventes, tempo de secagem da placa, distâncias de corrida, etc, são controladas via software winCATS previamente.

A placa é colocada dentro da cuba e os solventes em cada frasco. Pode-se usar até 5 solventes diferentes. Neste exemplo foram usados apenas 2 solventes.

A bomba puxa o primeiro solvente já na quantidade certa, configurada pelo software e leva para uma câmara de pré mistura.

Depois a bomba puxa o segundo solvente para a câmara.

Um pouco de ar entra no sistema para garantir a mistura homogênea.

Nesta etapa é feita a saturação da cuba com a fase gasosa

Quando os solventes já estiverem misturados a bomba leva a solução até a cuba, onde entrará em contato com a placa.

Quando o sensor CCD “enxergar” que a primeira mistura já atingiu a altura pré-definida na placa, a solução é retirada e há posterior secagem da placa por vácuo.

O próximo passo inicia-se com a nova dosagem dos solventes e mistura do gradiente e repete-se todo o processo até que as substâncias estejam separadas e resolvidas.

Abaixo uma tela do software que mostra a programação dos solventes e o diagrama de gradiente:

O sistema de desenvolvimento automático consegue controlar muito melhor todos os parâmetros, principalmente o mais crítico que é a saturação da fase gasosa.

No passado era preciso muita experiência em cromatografia para escolher e encontrar o sistema solvente adequado para um dado problema de separação. Com a técnica do AMD-2 a otimização do gradiente de solvente torna-se rotina!

Vamos a um exemplo desta otimização:

Determinação de Sulfonamidas em Rações Animais*

Sulfonamidas e antibióticos são administrados aos animais como suplementos alimentares. Sua identificação e quantificação seguras são tarefas para os laboratórios de vigilância e regulamentação.

Como os suplementos alimentares contêm complexas substâncias estranhas, os quais são extraídos junto com as drogas, é exigida uma separação cromatográfica confiável da matrix.

Além do alto poder de separação, o AMD-2 possui duas características úteis para este propósito:

- A distância de migração do componente individual é independente da matrix da amostra, o que não acontece no desenvolvimento normal, em apenas um passo

- Quando o densitograma é sobreposto com um diagrama de gradiente, conforme figuras dos passos abaixo, a região do gradiente que causa a separação das frações pode ser identificada

As moléculas são muito parecidas entre sulfadimidine e dimetridazole; a diferença é de apenas um grupo metil (CH₃), por isso a dificuldade na separação.

Passo 1

Foi usado gradiente universal normal baseado em diclorometano, fase gasosa básica

Resultado

- Não há separação de (1) e (2)

    (3) está razoavelmente separado

    Variando a fase gasosa para ácida há melhor separação de (3), mas não há mudança significativa de (1) e (2)

Conclusão

A seletividade precisa ser mudada. No AMD-2 isto significa mudar a base do solvente

Passo 2

Usado gradiente baseado em diisopropileter

Resultado

-  Todas as substâncias começam a se separar, porém a resolução é insuficiente

Conclusão

Diisopropileter é um solvente indicado

O gradiente deve ser mais fraco

A parte não polar não é necessária, isto é, o gradiente do diisopropileter para hexano

Passo 3

A partir das conclusões do passo 2, o gradiente foi definido.

Três passos de desenvolvimentos isocrático com metanol foram necessários para assegurar que nenhuma substância permaneceu na fase estacionária, na linha de aplicação da amostra onde analitos ficam escondidos.

Resultado

Boa separação e resolução dos três componentes

* O procedimento completo para determinação de sulfonamides e tetracyclines em rações é descrito em CAMAG Application Note A-29.

Em diversas outras aplicações, a separação também é melhorada com o uso do sistema de gradiente AMD-2.

Alguns métodos desenvolvidos pela Camag: Análise de carboidratos (CAMAG Application Note A-58), aminas carcinogênicas (CAMAG Application Note A-64), pesticidas em água potável (CAMAG Application Note A-28), fosfolipídeos (CAMAG Application Note A-52), gangliosídeos (CAMAG Application Note A-61), colesterol (CAMAG Application Note A-36).

Referências Bibliográficas:

CAMAG AMD System Catalogue
CAMAG Planar Chromatography 2003 Catalogue
CAMAG Application Notes
CAMAG Bibliography Service (CBS)
CAMAG Parameters of Planar Chromatography – Useful hints
Journal of Planar Chromatography
Bauer Karin, Gros Leo e Sauer Werner - Thin Layer Chromatography