Comparação da eficácia dos diversos corantes para viabilidade de leveduras

Boletim de Aplicação

Comparação da eficácia dos diversos corantes para
viabilidade de leveduras.

INTRODUÇÃO AO ANALISADOR DE VIABILIDADE CELULAR Vi-CELL.

Hoje em dia o desenvolvimento e a produção biológica na cultura de células e tecidos não pode considerar estimativas ou adivinhações na confirmação da viabilidade de populações celulares. Portanto, concentração de células e porcentagem de viabilidade de células devem ser determinadas com precisão e exatidão. O novo Vi-CELL, Analisador de Viabilidade de células proporciona uma forma econômica e automática de executar o método de exclusão usando o corante Trypan azul.

Estes dados são essenciais no processo decisivo na transferência na cultura de células e para conservar as melhores condições de cultura nos bioreatores. Aplicações de cultura de células e tecidos na pesquisa da ciência da vida, incluindo a o método de proteínas recombinantes e a produção de biofarmaceuticos, requerem exatidão, precisão e automatização disponível somente com o Analisador de Viabilidade Celular Vi-CELL.

O Vi-CELL automatiza o amplamente aceito método de exclusão por trypan azul. Historicamente, a determinação de viabilidade de células era feita usando um microscópio ótico com contagem manual na câmara de Neubauer. Esta técnica tem limitações pela forma subjetiva de contar as células, e sendo manual também consumindo muito tempo do usuário. Em comparação com a técnica manual, o Vi-CELL realiza automaticamente o método com o trypan azul utilizando uma célula de fluxo contínuo e um sistema de análise de imagem obtendo resultados em poucos minutos.

Comparação da eficácia dos diversos corantes para viabilidade de leveduras.
Por Stephen E Szabo Ph.D.
Gerente de Desenvolvimento de Aplicações Beckman Coulter, Inc

INTRODUÇÃO

Leveduras são microorganismos de células singelas que se reproduzem através de um processo chamada de budding. Uma propriedade bem conhecida da levedura é que a levedura é responsável para a conversão de açúcar em álcool e outros produtos secundários. Um desempenho consistente da levedura durante o processo de fermentação requer uma contagem de células de alta exatidão bem como informação sobre a viabilidade celular. Os principais mercados utilizando fermentação de levedura são as cervejarias e as indústrias produtoras de etanol.

Um parâmetro importante para a produção consistente de cerveja de boa qualidade é a presença de levedura viável.Um método comum usado para verificar o grau de viabilidade da levedura é o uso de um corante vital. A levedura viável não absorve o corante enquanto as células não metabolizantes de levedura não viável assumem a cor do corante escolhido. Um operador, usando um microscópio conta as centenas de células e calcula a razão entre as células coradas e a quantia total. O resultado é expresso em % de viabilidade.
Na industria de cerveja, o corante mais usado é metileno azul. De fato, metileno azul é aceito como padrão na industria1.
Entretanto, em anos recentes, foram publicados relatórios indicando que o metileno azul pode sobre estimar a viabilidade da levedura.2 Este corante foi reportado de não ser exato quando as viabilidades alcançam valores abaixo de 95%3.Por este motivo um corante alternativo, metileno violeta, foi testado por diversas comissões de normas como uma alternativa adequada para a determinação de viabilidade de levedura.4

Combustíveis contendo misturas de etanol representam mais que 12% das vendas de gasolina nos Estados Unidos.5 Desta forma a produção de etanol reduz a dependência de importação de energia diminuindo o preço da gasolina e beneficiando os consumidores. Para um processo eficiente , a viabilidade da levedura deve ser medida com exatidão. O processo de produção de etanol precisa medir uma faixa mais ampla de viabilidades celulares do que a industria de cerveja. Neste segmento o metileno azul não é o padrão e em muitos casos o metileno violeta é o corante escolhido na produção de etanol.6

Por outro lado o Trypan azul, usado numa solução de 0.4% de concentração, é o padrão de ouro de corante vital não-fluorescente usado em estudos de células mamarias. Uma vez, como documentado acima, comissão de normas em tanto a industria cervejeira como produção de etanol estão testando corantes vitais, nosso laboratório investigou a concordância entre estes três corantes para medição de viabilidade celular.

Usamos como organismo de teste o Saccharomyces cervisiae, a espécie mais usada em ambas as indústrias.

MATERIAIS E MÉTODOS

O corante metileno azul foi obtido da Sigma Chemical Co. O corante metileno violeta foi adquirido da ICN Biomedicals. O Trypan azul foi preparado pela EM Sciences.
A espécie de levedura, Saccharomyces cervisiae foi encomendada na Sigma Chemical. A levedura foi cultivada usando Trypticase Soy Broth.

RESULTADOS

A Figura 1 mostra a comparação de Trypan azul com metileno azul na faixa de viabilidades ensaiadas (40 a 90%)

A Figura 2 mostra a correlação dos corantes metileno azul e metileno violeta

A Figura 3 mostra a comparação dos 3 corantes sobre a faixa de viabilidades testadas.

CONCLUSÕES

O Trypan azul demonstrou ter uma excelente correlação com os corantes metileno azul e metileno violeta em uma ampla faixa de viabilidades.

Desta forma o Trypan azul é adequado para a medição de viabilidade da especie de levedura, Saccharomyces cervisiae.

REFERÊNCIAS

1. Land, M., Anderson, L., et. al. Citrate-Buffered Methylene Violet Stain As An Alternative to Conventional Stains Used to Determine Yeast Viability. Am.Soc. Brew. Chem. Pub.No. J-2001-1002-060, 2001.
2. Ibid
3. Mochaba, F., O’Connor, E.S., and Axell, B.C. Practical Procedures to Measure Yeast Viability and Vitality Prior to Pitching. AM. Soc. Brew. Chem. Pub. No. J-1998-0202-01R. 1999.
4. Smart, K.A., Chamber, K.M., et. al;. Use of Methylene Violet Staining Procedures to Determine Yeast Viability and Vitality. Am. Soc. Brew. Chem. Pub. No. J-1999-0204-03R, 1999.
5. Ethanol Plant Development Handbook. BBI International. 2001
6. Ingledew, M. University of Saskatchewan. Personal Communication.