Cromatografia em Camada Delgada de Alta Performance, uma Técnica Simples, Eficiente e Econômica.

A Cromatografia em Camada Delgada ou Cromatografia Planar é uma das técnicas pioneiras no âmbito das técnicas de separação, e ainda hoje muito utilizada para isolamento e identificação de espécies químicas diversas presentes em matrizes simples, tais como medicamentos, e complexas como extratos vegetais.

Apesar de muito utilizada, a Cromatografia em Camada Delgada é erroneamente conhecida como uma técnica estritamente qualitativa e que carece de sofisticação instrumental.

A afirmação acima é verdadeira caso a técnica seja executada da forma como Beyerlink a descreveu no ano de 1889, e assim como a Cromatografia em Coluna, a Cromatografia em Camada Delgada também se desenvolveu, ao ponto que atualmente podemos chamá-la de CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DE ALTA PERFORMANCE, cujo acrônimo conhecido do Inglês é HPTLC - High Performance Thin Layer Chromatography.

A Micronal representa com exclusividade no Brasil a empresa Pioneira na modernização de técnica, e por que não dizer, na reinvenção da Cromatografia em Camada Delgada?

Com o advento de instrumentos específicos a cromatografia em Camada Delgada deixou de ser uma técnica estritamente qualitativa e subjetiva, passando agora a contar com sistemas de detecção por Absorção nos comprimentos de Onda das radiações na faixa do visível, ultravioleta e também fluorescência, além de oferecer equipamentos de automação para atender desde as mais simples análises até as mais complexas.

Para atingir a sofisticação necessária para contar com todas as vantagens da Cromatografia em Camada Delgada, como simplicidade e baixo custo e ainda por cima poder realizar separações complexas com fins qualitativos ou quantitativos é necessário o uso de instrumentos para a execução de cada uma das principais etapas envolvidas: Aplicação de Amostra, Desenvolvimento/Eluição, Identificação/Quantificação.

A Primeira Etapa e mais importante é a APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS, as figuras abaixo mostram a diferença da aplicação de amostras manualmente ou por meio de equipamentos:

Repare que a medida que o volume de corante aplicado na placa vai aumentando também aumenta a difusão das manchas na placa em que as amostras foram aplicadas Manualmente (Spots), ao passo que na placa cuja as amostras foram aplicadas Instrumentalmente (Banda) a separação (resolução) é uniforme para qualquer um dos volumes aplicados.

Os Instrumentos para Aplicação Automática podem ser divididos em:

• Equipamento para Aplicação Semi Automática:

  
  • Linomat 5
  • - Ótima qualidade de Aplicação;
  • - Volumes de Aplicação Precisos;
  • - Preenchimento e Limpeza da Seringa feito manualmente.

Equipamento para Aplicação Automática:


• Automatic Sampler 4 (ATS 4)
• - Ótima qualidade de Aplicação;
• - Volumes de Aplicação Precisos;
• - Suporte para 66 Vials;
• - Preenchimento e Limpeza da Seringa feito Automaticamente.

Além de melhorarem a qualidade de aplicação, os aplicadores instrumentais visam automatizar o processo de aplicação, chegando a ser até 50 vezes mais rápidos do que os processos manuais.

A Segunda Etapa é a de Desenvolvimento/Eluição das Amostras, a instrumentação dessa etapa além de garantir a reprodutibilidade dos resultados também aumenta o poder de separação e automatiza todo o processo.

Os Instrumentos para Aplicação Automática podem ser divididos em:

• Equipamento para Desenvolvimento Isocrático Automático :

  
  • Automatic Development Chamber 2 (ADC2);
  • - Desenvolvimento/Eluição em modo Isocrático;
  • - Processos de Saturação e Pré Condicionamento Automáticos;
  • - Deixa a Placa pronta Para o usuário sem a necessidade de acompanhamento do processo.
  
  

Automated Multiple Development 2 (AMD2)


• Automatic Development Chamber 2 (ADC2);
• - Desenvolvimento/Eluição em modo de Gradiente;
• - Processos de Saturação e Pré Condicionamento Automáticos;
• - Deixa a placa pronta para o usuário, sem a necessidade de acompanhamento do processo.

A Terceira Etapa é a de Identificação e Quantificação, e a forma como é feita depende da intenção final do usuário, podendo contar com um ou mais equipamentos para isso:

Técnica de Identificação e Quantificação por Densitometria UV/VIS e Fluorescência:

É a mais sofisticada das técnicas de identificação e quantificação em Cromatografia em Camada Delgada, consiste no uso de um equipamento capaz de gerar o espectro de absorção e quantificar na faixa de luz de 190 a 900 nm.Sendo possível realizar até 18 análises quantitativas em poucos minutos !

Como funciona:

Substâncias separadas podem ou não ser visualizadas a olho nu (Fig. 1), e essas substâncias são quantificadas por Absorção UV/VIS ou Fluorescência (190 a 900 nm) (Fig. 2) após previa determinação do pico de absorção através de um espectro de absorção (Fig. 3). O uso de Padrões analíticos é obrigatório e a quantificação das amostras é feita através da equação da reta obtida através da curva padrão.(fig. 4)

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Equipamento para Identificação por Densitometria UV/Vis e Fluorescência:

• TLC Scanner 4
• - Densitometria UV/Vis e Fluorescência (190 a 900 nm)
• - Até 18 Análises Quantitativas em Poucos Minutos.

Técnica de Fotodocumentação:

Uma placa de Cromatografia em Camada Delgada pode ser visualiza e fotodocumentada utilizando diferentes tipos de luzes (Fig. 1), quando as amostras são aplicadas juntamente com os padrões a identificação poderá ser feita comparando-se a posição e cor das bandas obtidas. Com o uso de um software é possível fazer a quantificação das substâncias por Videodensitometria, uma técnica que correlaciona os pixels formados com a concentração das substâncias (Fig 2), gerando picos, cujas áreas podem ser quantificadas.

Figura 1

Figura 2

Equipamento para Identificação e Quantificação por Fotodocumentação.

• TLC Visualizer
• - Fotodocumentação de Placas no Vísivel e UV;
• - Identificação;
• - Quantificação por Videodensitometria

Técnica de Espectrometria de Massas:

Atualmente a Espectrometria de Massas é considera uma técnica padrão ouro para identificação de substâncias, e através de um equipamento, atualmente é possível fazer a interface direta com um espectrômetro de massas para fins qualitativos:

Equipamento para Interface com Espectrômetro de Massas:


• TLC MS Interface
• - Interface Rápida Com Espectrômetro de Massas;
• - Opcionalmente pode servir apenas para coletar frações em vials ou tubos de ensaio.

Vantagens da Cromatografia em Camada Delgada de Alta Performance

Com o advento da Instrumentação para Cromatografia em Camada Delgada é possível então afirmar que atualmente ela pode complementar e competir com outras técnicas cromatográficas.

Algumas Vantagens:

• Menor Custo e Tempo de Análise;
  - Em uma placa de HPTLC, até 18 amostras podem ser analisadas ao mesmo tempo! O tempo de análise é reduzido em até 50 vezes quando comparado a um sistema de coluna e o gasto com fase móvel é cerca 11 vezes menor


• Não há necessidade de pré tratamento rigoroso da amostra;
  - As placas são utilizadas apenas uma vez, a amostra pode ser aplicada na placa sem qualquer pré tratamento, como filtração e degaseificação.


• Permite avaliação visual da placa e geração de um cromatograma para Facilitar a Identificação;
  
  

  

Exemplos de Aplicações Avançadas em Cromatografia em Camada Delgada Instrumental